Javascript ist derzeit in Ihrem Browser deaktiviert.Mehrere Funktionen dieser Website funktionieren nicht, wenn Javascript deaktiviert ist.freier Zugang zu wissenschaftlicher und medizinischer ForschungPeer-reviewte wissenschaftliche und medizinische Open-Access-Zeitschriften.Dove Medical Press ist Mitglied des OAI.Massennachdrucke für die pharmazeutische Industrie.Wir bieten unseren Autoren echte Vorteile, einschließlich einer beschleunigten Bearbeitung von Papieren.Registrieren Sie Ihre spezifischen Daten und spezifischen Arzneimittel von Interesse und wir gleichen die von Ihnen bereitgestellten Informationen mit Artikeln aus unserer umfangreichen Datenbank ab und senden Ihnen umgehend PDF-Kopien per E-Mail zu.Zurück zu Zeitschriften » International Journal of Nanomedicine » Volume 13Autoren Lara HH, Guisbiers G, Mendoza J, Mimun LC, Vincent BA, Lopez-Ribot JL, Nash KLVeröffentlicht am 3. Mai 2018 Band 2018:13 Seiten 2697—2708DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S151285Begutachtung durch einmaliges anonymes Peer-ReviewHerausgeber, der die Veröffentlichung genehmigt hat: Dr. Thomas J. WebsterHumberto H. Lara, 1. Gregory Guisbiers, 2. Jonathan Mendoza, 3. Lawrence C. Mimun, 4. Brandy A. Vincent, 3. Jose L. Lopez-Ribot, 1. Kelly L. Nash3 San Antonio, San Antonio, TX, USA;2Department of Physics and Astronomy, University of Arkansas at Little Rock, Little Rock, AR, USA;3Department of Physics and Astronomy, The University of Texas at San Antonio, San Antonio, TX, USA;4US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, USA Hintergrund: Candida albicans ist ein bedeutender opportunistischer Pilzpathogen.Einer der wichtigsten Virulenzfaktoren, die zur Pathogenese der Candidiasis beitragen, ist ihre Fähigkeit, Biofilme zu bilden.Ein Schlüsselmerkmal von Candida-Biofilmen ist ihre Resistenz gegenüber Antimykotika.Aufgrund der erheblichen Morbiditäts- und Mortalitätsraten im Zusammenhang mit Biofilm-assoziierter Arzneimittelresistenz ist es dringend erforderlich, neuartige, auf Nanotechnologie basierende Ansätze zu entwickeln, um biofilmbedingte Infektionen zu verhindern.Methoden: In dieser Studie berichten wir zum ersten Mal über die Synthese von Selen-Nanopartikeln durch Bestrahlung von Selen-Pellets durch gepulste Nanosekunden-Laserablation in flüssigem Chitosan als Verkappungsmittel.Die Synergie der fungiziden Wirkung von Selennanopartikeln und Chitosan wurde durch das Kombinationsindextheorem von Chou-Talalay quantifiziert.Ergebnisse: Diese Arzneimittelkombination führte zu einer starken fungiziden Wirkung gegen einen vorgeformten C. albicans-Biofilm in einer Dosis-Wirkungs-Weise.Durch fortschrittliche Elektronenmikroskopietechniken dokumentierten wir die adhäsiven und permeabilisierenden Eigenschaften von Chitosan, wodurch Selen-Nanopartikel eindringen konnten, wenn die Zellwand der Hefe zerstört und verzerrt wurde.Am wichtigsten ist, dass wir einen starken quantitativen synergistischen Effekt zeigten, wenn Verbindungen wie Selen und Chitosan kombiniert wurden.Schlussfolgerung: Diese Chitosan-stabilisierten Selen-Nanopartikel könnten für Ex-vivo-Anwendungen wie Sterilisatoren für Oberflächen und biomedizinische Geräte verwendet werden.Schlüsselwörter: Selennanopartikel, Laserablation in Flüssigkeiten, Candida albicans, Biofilm, Chitosan, SynergieC. albicans ist ein bedeutender opportunistischer Pilz, der ein breites Spektrum an Krankheiten verursachen kann.Candidiasis ist die vierthäufigste im Krankenhaus erworbene Blutstrominfektion (BSI) in den USA und verursacht eine schwere Sepsis.1 Einer der wichtigsten Faktoren, die zur Pathogenese der Candidiasis beitragen, ist ihre Fähigkeit zur Bildung eines Biofilms.2 Verweilende prothetische Materialien und die meisten Katheter stellen ideale Oberflächen für die Anhaftung und das Wachstum von Candida-Biofilmen dar.Daher ist Candida der am häufigsten isolierte Pilzpathogen bei katheterbedingten BSIs (CRBSIs), was zu hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten bei Krankenhauspatienten führt.3 Candida-Biofilme sind von einer Matrix aus exopolymerer Substanz oder extrazellulärer polymerer Substanz (EPS) eingeschlossen, die den Pathogen schützt vor ungünstigen Umwelteinflüssen4, der Immunabwehr des Wirts und Fungiziden.Darüber hinaus sind vom Biofilm abgelöste Hefen die Infektionsquelle durch die Verbreitung des BSI.5 Morphogenetische Umwandlungen zwischen Hefe und Hyphen spielen eine Schlüsselrolle bei der Biofilmbildung und stellen einen wichtigen Virulenzfaktor für die Pathogenese von Krankheiten dar.6 Das Hauptmerkmal des Candida-Biofilms ist die hohes Maß an Arzneimittelresistenz, die im Vergleich zu ihren planktonischen (frei suspendierten) Gegenstücken bis zu 1.000-fach überdauern kann.7 Da Candida-Biofilme eine geringere Anfälligkeit für derzeit vorhandene Antimykotika aufweisen,7,8 besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuartiger nanotherapeutischer Kombinationsansätze für die Behandlung von Candida-Biofilmen.9Kombinierte medikamentöse Therapie und SynergieEine medikamentöse Kombinationstherapie ist die Verwendung von zwei oder mehr pharmakologischen Wirkstoffen;dies ist eine klinische Standardpraxis bei der Behandlung von antibiotikaresistenten Infektionen.10 Diese Kombinationstherapie soll eine Synergie erzielen,11 definiert als die Wechselwirkung von zwei oder mehr Arzneimitteln, um eine kombinierte Wirkung zu erzielen, die größer ist als die Summe ihrer Einzelwirkungen.12 Synergie kann durch eine Analyse des Hemmtests durch die CompuSyn-Software nachgewiesen werden, die den Kombinationsindex (CI) mit einer quantitativen Definition für additive Wirkung (CI = 1), Synergismus (CI < 1) und Antagonismus (CI > 1) zeigt.Der Satz von Chou-Talalay liefert auch Algorithmen für die automatisierte Computersimulation für Synergismus, wie im CI-Plot gezeigt.13 Die auf dem Massenwirkungsgesetz13–15 basierende Software CompuSyn16 ist eines der am häufigsten zitierten Softwarepakete.17Da Selen(Se)-Sulfid bei der Behandlung von oberflächlichen Mykosen in Form eines topischen antimykotischen Shampoos18 verwendet wird und SeNPs fungizide Wirkungen gegen C. albicans-Biofilme gezeigt haben,19 entschieden wir uns, reine SeNPs in Kombination mit Chitosan (CS) oder allein zu testen gegen einen vorgeformten C. albicans Biofilm.Se ist ein natürlich vorkommendes metalloides Spurenelement, das aufgrund seiner dynamischen Rolle bei der Hemmung der Bildung freier Radikale als Nährstoff mit wichtigen Vorteilen für die menschliche Gesundheit von entscheidender Bedeutung ist;daher verhindert Se oxidativen Stress, eine Hauptquelle altersbedingter Krankheiten;20 es gibt ungefähr 25 bekannte Selenoproteine, die in das menschliche Genom eingebaut sind;21 jedoch wird Se in großen Mengen toxisch, wobei eine schmale Spanne zwischen nützlichen und toxischen Wirkungen gezeigt wird.22 Hefen der Gattung Candida haben die Fähigkeit, große Mengen an Spurenelementen21, die als organische Verbindungen eingebaut sind, (innerhalb der Zelle) anzureichern.23 Die Mechanismen der Anreicherung und Umwandlung von Se in die Zellwand(CW)-Architektur von C. albicans sind noch immer unklar.23 Se gelangt durch Chemisorption in die Hefe unter Bildung ionischer Bindungen durch die CW-Polymere.23–25 Die fungizide Wirkung kann auf die Vermischung von Se mit Zellproteinen zurückzuführen sein, in denen Se Schwefel verdrängt (aufgrund der chemischen Analogie beider Elemente), B. für schwefelhaltige Aminosäuren wie Cystein (Cys) und Methionin (Met).23 Hefen absorbieren Se in das Cytosol, indem sie Transporter wie die Sulfat-Permeasen Sul1 und Sul2 verwenden.26 Selenoproteine in zXcess erzeugt reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die DNA-Strangbrüche verursachen;27 dieser Prozess kann zu Veränderungen in der Proteinfehlfaltung, Stabilität, strukturellen Veränderungen und Enzymfehlfunktionen führen.21,23–25 Die toxische Aktivität von anorganischen Se-Verbindungen in Hefen ist an der Reaktion beteiligt von Seleniten mit thiolhaltigen Verbindungen.25 Daher haben SeNPs eine Anti-Candida-Biofilm-Wirkung gezeigt.19Eine weitere Verbindung, die in dieser Studie allein oder in Kombination mit SeNPs getestet wurde, war CS, ein wirksames Verkappungs- und Stabilisierungsmittel von SeNPs28,29 mit fungizider Wirkung.30–32 CS ist ein Polysaccharidderivat von Chitin, das aus Pilzen, Arthropoden wie Krebstieren und Insekten extrahiert wird .Es ist ein biokompatibles, natürliches, biologisch abbaubares, bioadhäsives und positiv geladenes Polymer mit geringer Zytotoxizität.33 Die mikrobiziden und fungiziden Eigenschaften von CS sind gut etabliert.30 Die polykationischen Wirkstoffe des Polymers interagieren mit anionischen Bestandteilen der Hefe, wodurch die negative Oberflächenladung reduziert wird das äußere CW führt zu einer starken Bindung des Biopolymers, wodurch das CW permeabilisiert wird.30,34 CS-dekorierte SeNPs (CS-SeNPs), die durch chemische Methoden synthetisiert wurden, wurden zuvor in der Krebsforschung untersucht.28,29Nanotechnologien haben ein bemerkenswertes Potenzial gegen Infektionen gezeigt;35 daher besteht ein dringender Bedarf, neuartige Nanotechnologie-basierte Medikamente allein und in Kombination zu entwickeln, um die Biofilm-Arzneimittelresistenz zu überwinden.36,37 C. albicans-Biofilmhemmung durch Silbernanopartikel (AgNPs)38,39 oder SeNPs wurde bereits berichtet;40–42 unsere Gruppe beschrieb zuvor die Hemmung eines vorgeformten Biofilms durch SeNPs, die mit einem Femtosekundenlaser synthetisiert wurden, und wir zeigten, dass Kristallinität und Größe die beiden wichtigsten physikalischen Parameter von SeNPs sind, die die Lebensfähigkeit von C beeinflussen. albicans Biofilme.19Durch Laserablation im Nanosekundenbereich in Flüssigkeiten synthetisierte CS-SeNPsIn dieser Studie berichten wir zum ersten Mal über die Synthese von SeNPs durch Bestrahlung von Se-Pellets, die in entionisiertes (DI) Wasser getaucht wurden, das zu 0,25 % aus CS besteht (CS-SeNPs).Die Bestrahlung wurde unter Verwendung eines gepulsten Nanosekunden-Lasers mit neodymdotiertem Yttrium-Aluminium-Granat (Nd:YAG) erreicht.Die Fähigkeit, kontaminationsfreie reine Nanopartikel zu synthetisieren, ist für biomedizinische Anwendungen unerlässlich.Nach unserem besten Wissen ist dies das erste Mal, dass CS-SeNPs gegen einen vorgeformten reifen C. albicans-Biofilm getestet wurden, was auch zeigt, dass die Kombination von SeNPs und CS eine starke fungizide Wirkung in einer dosisabhängigen Weise hat, gemessen durch a etablierten phänotypischen Assay,43–45 und vor allem haben wir eine starke synergistische fungizide Wirkung mit der Kombination von CS mit SeNPs gegen die Biofilme von C. albicans gezeigt.Die Synergie wurde mit der CompuSyn-Software46 analysiert, um den synergistischen Effekt quantitativ zu bestimmen;13,15 wir analysierten das CI mit den Daten der nichtlinearen Dosis-Wirkungs-Kurven (effektbasierte Ansätze).12 Schließlich zeigten wir durch fortgeschrittene Elektronenmikroskopie (EM) dass CS-SeNPs das äußere CW aufgrund von CS-Eigenschaften permeabilisieren, wodurch Se eindringen kann.Die Veränderung der charakteristischen kugelförmigen Struktur der Candida-Zellen ist auf eine Proteinfehlfaltung zurückzuführen, die eine durch Se-Toxizität induzierte Strukturänderung verursacht.21,23–26 Wir schließen daraus, dass CS-SeNPs einen synergistischen Effekt mit einer wirksamen Dosis-Wirkungs-Hemmung von haben der vorgeformte reife Biofilm in vitro.Weitere Studien sind gerechtfertigt, um die synergistische Wirkung der Kombination von Se und CS gegen den Candida-Biofilm zu verstehen.Se-Pellets (Se, <5 mm, ≤99,999 % Spurenmetalle), CS (niedriges Molekulargewicht), Natriumhydroxid (NaOH, Reagenz der American Chemical Society [ACS], ≥97,0 %, Pellets) und Essigsäure (ACS-Reagenz, ≥99,7 %) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen.Molekularbiologisches Wasser (MT46000CM) wurde von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) erworben.Die Synthese von SeNPs und CS-SeNPs wurde unter Verwendung einer Nanosekunden-Laserquelle durchgeführt, indem 0,35 g Se-Pellets (Reinheit 99,9 %) als Target auf den Boden eines 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchens gegeben wurden, das 0,5 ml DI-Wasser oder 0,25 % ( wt/vol) CS-Lösung.Der für die Bestrahlung verwendete Laser (Ekspla, NT342A, Vilnius, Litauen) war der Nd:YAG mit einer Laserpulsdauer von 3,6 ns bei einer Wellenlänge von 1.064 nm und einer Wiederholungsrate von 20 Hz.Der Laserstrahl wurde senkrecht von oben in das offene Mikrozentrifugenröhrchen auf das Target gerichtet, wo der Strahl auf die unten platzierten reinen Se-Pellets fokussierte.Das Target wurde 15 min lang bestrahlt, wodurch eine rot-orange Farbe in der Lösung erzeugt wurde, die zur weiteren Analyse extrahiert wurde.Die in der 0,25 % (wt/vol) CS-Lösung produzierten SeNPs wurden gewaschen, um überschüssiges CS aus der Probe zu entfernen.Eine Säurewäsche wurde unter Verwendung einer 50/50-Lösung aus Essigsäure und entionisiertem Wasser durchgeführt, die der Probe zugesetzt und dann zentrifugiert wurde, um ein in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiertes Pellet herzustellen.Die SeNPs wurden durch Bestrahlen von Se-Pellets unter Verwendung des Nanosekundenlasers hergestellt, der von einem 20 Hz gütegeschalteten Nd:YAG-Laser mit einer Leistung von 20 mJ gepumpt wurde.Die Bestimmung der Konzentration der Lösung erfolgte mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AA-6200; Shimadzu, Kyoto, Japan) mit einer Se-Lampe (L2433-34NQ; Hamamatsu, Boston, MA, USA).Die hydrodynamische Größe und das Zetapotential (ZP) von SeNPs wurden mit dem dynamischen Lichtstreuungssystem (DLS) (Zetasizer Nano ZS; Malvern Instruments, Malvern, UK) bei 25 °C charakterisiert.Das hochauflösende Transmissionselektronenmikroskop (HRTEM) (JOEL 2010F) und das Mikroskop mit atomarer Auflösung (ARM, JOEL ARM 200F) wurden verwendet, um Bilder der SeNPs aufzunehmen, um die Größe und Form der Nanopartikel unter Verwendung der Cs-Sonde bei einer Spannung von zu bestimmen 200 kV mit einer Ortsauflösung von 0,75 Å.Die speziell aufgelöste Elementaranalyse wurde durch Röntgenemissionsspektroskopie-Anbindung an das HRTEM durchgeführt.Stamm, Medien und KulturbedingungenDer Wildtyp C. albicans klinischer Stamm SC531447 wurde in allen Experimenten als Kontrollstandard verwendet.Außerdem verwendeten wir TW148 und zwei gegen Fluconazol resistente klinische Isolate von C. albicans, die wie zuvor beschrieben als TW1748,49- und 648650,51-Stämme bezeichnet wurden.Gefrorene Zellen aus bei –80 °C gelagerten Beständen wurden über Nacht in Hefe-Pepton-Dextrose (YPD)-Agarplatten vermehrt.Kolben mit YPD-Flüssigmedium wurden mit einer Öse voll Candida-Wachstum inokuliert und in einem Orbitalschüttler (180 U/min) bei 30 °C inkubiert und 14–16 h gezüchtet.Biofilme wurden unter Verwendung der 96-Well-Mikrotiterplatten-basierten Methode wie zuvor berichtet bewertet.43Aktivität gegen einen vorgeformten C. albicans-BiofilmBiofilme wurden mit einer bekannten Methode auf Mikrotiterplattenbasis mit 96 Vertiefungen bewertet.43 Kurz gesagt, Hefezellen, die aus Übernachtkulturen gesammelt wurden, wurden in sterilem PBS gewaschen und in einer Endkonzentration von 1,0 × 106 Zellen/ml im Roswell Park Memorial Institute resuspendiert ( RPMI) mittel-1640.Biofilme wurden auf mit Gewebekultur behandelten Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Corning Incorporated) gebildet, die 24 h lang bei 37°C inkubiert wurden.Die gebildeten und am flachen Boden der Vertiefungen haftenden Biofilme wurden zweimal mit PBS gewaschen.CS-SeNPs, SeNPs und CS wurden gegen den vorgeformten Biofilm auf ihre fungizide Aktivität bei Konzentrationen im Bereich von 5 bis 2.500 bzw. 0,05 bis 25 ppm für CS und SeNPs in seriellen zweifachen Verdünnungen wie zuvor beschrieben bewertet.43,44,58 Die Platten wurden mit Parafilm abgedeckt und für weitere 24 h inkubiert.Dann wurden die Platten zweimal sorgfältig gewaschen, und die Biofilme wurden unter Verwendung der Tetrazoliumsalz-Reduktion (2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilid [XTT]) quantifiziert Assay zur Prüfung der Wirksamkeit der Nanopartikelpräparate.Alle Tests wurden doppelt durchgeführt und in unabhängigen Experimenten mindestens dreimal wiederholt.Die IC50 wurde mit den Dosis-Wirkungs-Anpassungen durchgeführt, die mit der Software Origin 9 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) berechnet wurden.59Eine Stammlösung von CS-SeNPs wurde auf die gewünschten Konzentrationen im Bereich von 50 bis 1 ppm in Wachstumsmedium verdünnt und anschließend in eine Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, die die humane retinale Pigmentepithelzelllinie ARPE-19 (5 × 10 4 Zellen/Vertiefung) enthielt.Mikrotiterplatten wurden bei 37°C in einer luftbefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 für 24 h inkubiert.Die Zellexperimente wurden dreifach durchgeführt, und Ablesungen der Zelllebensfähigkeit unter Verwendung eines lumineszierenden Zelllebensfähigkeitsassays (CellTiter-Glo; Promega Corporation, Madison, WI, USA) wurden nach 24 h durchgeführt.Visualisierung der Auswirkungen von Nanopartikeln auf vorgeformte C. albicans-Biofilme durch SEMFür die ultrastrukturelle SEM-Beobachtung der reifen Biofilme, die 24 h auf 48-Well-Platten kultiviert wurden und mit CS-SeNPs (3,5 ppm), SeNPs (21,7 ppm) und CS (25.000 ppm) behandelt wurden, wuschen wir den behandelten Biofilm zweimal vorsichtig mit PBS und mit 4 % Formaldehyd und 1 % Glutaraldehyd (GA) für 1 h bei Raumtemperatur fixiert.Die fixierten Proben wurden mit PBS gewaschen und dann in 1 %iger Osmiumtetroxid (OsO4)-Lösung, gepuffert mit PBS, für 1 h gefärbt.Die Proben wurden mit einer Reihe von Ethanollösungen dehydriert (25 % für 10 min, 50 % für 10 min, 70 % für 10 min, 95 % für 10 min und absoluter Alkohol für 20 min).60 Die dehydrierten Proben wurden dann übertragen zu kohlenstoffbeschichteten Kupfergittern mit Maschenweite 300, die durch SEM in einem Hitachi S-5500 (Hitachi Ltd., Tokio, Japan) zu beobachten sind.Visualisierung der Auswirkungen von Nanopartikeln auf vorgeformte C. albicans-Biofilme durch TEMFür die ultrastrukturelle TEM-Bildgebung wurden Candida-Biofilme für 24 h gezüchtet und dann mit CS-SeNPs (3,5 ppm) behandelt.Der behandelte reife Biofilm wurde dann 10 min bei 3.500 U/min zentrifugiert.Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen in 1 ml 4 % Formaldehyd und 1 % GA für 2 h fixiert.Die fixierten Proben wurden mit 1 % OsO4 für 1 h gefärbt.Nach dem Waschen der Candida-Biofilme mit PBS zur Entfernung der Schwermetallverfärbung wurde eine Dehydratisierungsreihe mit 25, 50, 75, 95 und 100 % Ethanol, verdünnt in dH2O, durchgeführt.Die absolute Dehydratisierung wurde mit Propylenoxid vor dem Einbetten in ein Epoxidharz LX-112 (Ladd Research Industries, Williston, VT, USA) sichergestellt, und das Harz wurde 48 h bei 60°C zum Aushärten belassen.Die in Epoxidharz eingebetteten Schnitte wurden unter Verwendung eines Ultramikrotoms (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) und eines 45°-Winkel-Diamantmessers wie zuvor beschrieben geschnitten (90 nm dick).61 Ultradünne Schnitte wurden auf ein unbeschichtetes Kupfergitter montiert und mit JEOL sichtbar gemacht JEM-2010F.Das CI-Theorem der Chou-Talalay-Analysen13,14 wurde mit der Computersoftware CalcuSyn15,16 Version 2.0 (Biosoft, Cambridge, UK) berechnet.46 Wir analysierten das CI basierend auf den nichtlinearen Dosis-Wirkungs-Kurven (wirkungsbasierte Ansätze).12 To Analysieren Sie die Dosis-Wirkungs-Parameter (% Hemmung des Biofilms) jeder Verbindung allein (CS und SeNPs) sowie in Kombination (CS-SeNPs) und berechnen Sie den CI-Wert, die Parameter können automatisch aus der Median-Effekt-Gleichung bestimmt werden .13 Umfassende Verfahren der automatisierten dynamischen Dosis-Wirkungs-Analyse über mathematische Induktion zur Quantisierung des Synergismus in Arzneimittelkombinationsstudien sind im Benutzerhandbuch für die CompuSyn-Software angegeben.14 Kurz gesagt wurde die CI-Isobologramm-Gleichung verwendet, wobei CI-Werte um 1 Additiv zeigen Wirkungen der beiden getesteten Medikamente.CI < 1 zeigt eine synergistische Wirkung der beiden kombinierten Arzneimittel an, und CI > 1 zeigt eine antagonistische Wirkung an.Wir müssen jedes Dosis-Wirkungs-Ergebnis wie in Tabelle 1 gezeigt eingeben.Tabelle 1 Synergie basierend auf den nichtlinearen Dosis-Wirkungs-Kurven Anmerkungen: Diese Tabelle wurde aus den vom CompuSyn-Bericht generierten Daten erstellt.aDie Daten der nichtlinearen Dosis-Wirkungs-Kurven stammen aus dem XTT-Assay und wurden mit der CompuSyn-Software analysiert.Die Daten sind als Mittelwert (±SEM) von drei unabhängigen Experimenten dargestellt, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden.bCI wurde aus der CI-Gleichung und den Algorithmen unter Verwendung der CompuSyn-Software berechnet.Wenn der CI 1 ist, ist die Wechselwirkung für die inhibitorische Wirkung additiv, CI > 1 ist antagonistisch und CI < 1 bedeutet eine synergistische Wirkung.Fettgedruckte Werte sind synergistisch.Abkürzungen: CI, Kombinationsindex;CS, Chitosan;Fa, Fraktion betroffen;SEM, Standardfehler des Mittelwerts;SeNPs, Selennanopartikel;XTT, 2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilid.Die IC50 wurde durch Dosis-Wirkungs-Anpassung unter Verwendung der Origin 9-Software berechnet.Die Diagramme zeigen den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus drei getrennten Experimenten, die doppelt durchgeführt wurden.Für quantitative Assays wurden statistische Analysen mit Student's t-Test durchgeführt.Statistische Signifikanz wurde bei einem P-Wert von < 0,05 akzeptiert.Der durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser der in DI-Wasser dispergierten CS-SeNPs betrug etwa 96 nm, bestimmt durch DLS (Abbildung 1A).Das ZP hatte eine negative Ladung von etwa –35,7 mV (Abbildung 1B).Die durch Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) bestimmte Konzentration der Lösung betrug 25,5 ± 0,5 ppm.Energiedispersive Spektroskopie (EDS)-Spektren von CS-SeNPs zeigen das Vorhandensein eines Se-Signals in der Probe durch Spektralkartierungserfassung (Abbildung 2).SeNPs wurden auf dem äußeren CW von C. albicans (rote Punkte) durch EDS-Kartierung nachgewiesen.Für die Nanopartikel, die in Gegenwart von CS (CS-SeNPs) hergestellt wurden, zeigen HRTEM-Bilder eine sphärische Form der Nanopartikel, und das Beugungsmuster von kleinen und großen Nanopartikeln weist darauf hin, dass beide kristalliner Natur sind.Die CS-Matrix, die die Nanopartikel umgibt, kann beobachtet werden (Abbildung S1A–D);Diese CS-Matrix verstärkt die kristalline Natur des Nanopartikels im Vergleich zur amorphen Natur von in DI-Wasser hergestellten SeNPs.Die Stabilität der Nanopartikel aufgrund des CS wurde durch ZP demonstriert, das eine negative Ladung von etwa –35,7 mV aufwies, wobei die Bindungseffekte des CS an das Nanopartikel die Stabilität der Nanopartikel aufrechterhalten.Abbildung 1 DLS und ZP.Hinweise: (A) Hydrodynamische Durchmesser der synthetisierten SeNPs, stabilisiert in Rinderserumalbumin und dispergiert in DI-Wasser;die durchschnittliche Größe der Nanopartikel beträgt 96,3 nm.(B) Das ZP zeigte eine negative Ladung von –35,7 mV.Abkürzungen: DI, deionisiert;DLS, dynamische Lichtstreuung;SeNPs, Selennanopartikel;ZP, Zetapotential.Abbildung 2 EDS-Spektrum von SeNPs.Hinweise: Se EDS-Peaks sind gekennzeichnet.Starke Signale von den Atomen in den im Spektrum beobachteten SeNPs bestätigen metalloide Se-Nanopartikel auf dem äußeren CW der Hefe durch Spektralkartierungserfassung.Abkürzungen: CW, Zellwand;EDS, energiedispersive Spektroskopie;Se, Selen;SeNPs, Selennanopartikel;UTSA, Universität von Texas in San Antonio.In dieser Studie verwendeten wir einen etablierten phänotypischen Assay, wie er von Pierce et al.44 und Pierce und Lopez-Ribot45 berichtet wurde IC50 von 21,7 ppm.CS allein hatte eine hemmende Wirkung auf den Biofilm, wobei eine 7%ige Hemmung bei 25 ppm erreicht wurde.CS-SeNPs zeigten die stärkste Hemmung gegen vorgeformte Biofilme in einer Dosis-Wirkungs-Weise mit einem IC50 von 3,5 ppm, was auf einen starken synergistischen Effekt im Vergleich zu beiden Verbindungen allein hinwies (Abbildung 3A).Wir verglichen auch die Aktivität von CS-SeNPs auf vorgeformten Biofilmen von zwei arzneimittelempfindlichen Stämmen (SC531447 und TW148) und zwei arzneimittelresistenten C. albicans-Stämmen (TW1748,49 und 648650,51).Es wurde kein statistischer Unterschied in den Dosis-Wirkungs-Kurven zwischen sensitiven und resistenten klinischen Stämmen beobachtet.Statistische Signifikanz wurde bei einem P-Wert von < 0,05 akzeptiert.Abbildung 3 Dosis-Wirkungs-Kurven.Anmerkungen: (A) Dosis-Wirkungs-Kurven für die Aktivität von SeNPs, CS und CS-SeNPs gegen vorgeformte C. albicans-Biofilme.Die Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) wurden als SeNPs (21,7 ppm) und CS-SeNPs (3,52 ppm) berechnet.Die Werte sind der Mittelwert ± SEM (Fehlerbalken) aus unabhängigen Experimenten, die doppelt durchgeführt wurden.(B) Zytotoxizität von CS-SeNPs in RPE-19-Zellen, die 50 % zytotoxische Konzentration (CC50) beträgt 26,3 ppm.Die Zytotoxizität von CS-SeNPs wurde durch einen Luciferase-Assay nach 24-stündiger Inkubation der Verbindung quantifiziert.X-Achse, Konzentration in ppm;Y-Achse, Prozentsatz der Zellzytotoxizität.Dosis-Wirkungs-Kurven wurden mit Origin 9 Curve Fit gezeichnet.Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten dar, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden.(C) Das CI wurde bestimmt.Eine horizontale rote Linie markiert CI=1.Die Daten sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten.Kombinierte Dosen von CS und SeNPs von 160–1,6 bis 25.000–25 ppm führten zu Fa von 0,6 bis 0,9 mit einem CI < 1 (Synergie).Dosen unter 3,5–35 ppm CS-SeNPs waren jeweils antagonistisch.Abkürzungen: C. albicans, Candida albicans;CI, Kombinationsindex;CS, Chitosan;CS-SeNPs, CS-dekorierte SeNPs;Fa, Fraktion betroffen;SEM, Standardfehler des Mittelwerts;SeNPs, Selennanopartikel.Die CS-SeNP-Konzentrationen, die starke fungizide Wirkungen gegen reife C. albicans-Biofilme zeigen (3,5 ppm), sind niedriger als diejenigen, bei denen sie Zytotoxizität zeigen, wie durch einen Zytotoxizitätstest unter Verwendung menschlicher ARPE-Zellen (erhalten von der American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA), was zu einer 50 %igen Zytotoxizitätskonzentration (CC50) von 26,3 ppm führt (Abbildung 3B).Visualisierung durch Scannen von EM (SEM) der Auswirkungen von Nanopartikeln auf vorgeformte C. albicans-BiofilmeDie ultrastrukturellen Veränderungen wurden unter SEM nach Behandlung mit CS, SeNPs und CS-SeNPs abgebildet.4A zeigt unbehandelte Biofilme von C. albicans SC5314 mit einem dichten Netzwerk aus Hefezellen und Hyphen;Hefezellen zeigen eine charakteristische eiförmige Morphologie.4B zeigt C. albicans-Biofilme, die mit CS bei 25.000 ppm behandelt wurden;Hefezellen wurden vergrößert und deformiert;CS haftet am äußeren CW der Zellen.C. albicans behandelt mit SeNPs bei 21,7 ppm (Abbildung 4C) hat Veränderungen in der Morphologie (rote Pfeile).Hefen, die mit CS-SeNPs bei 3.500–3,5 ppm behandelt wurden, zeigen größere Veränderungen in Morphologie und Struktur.Rote Pfeile zeigen eine starke Verformung der Hefezellen und des polykationischen Polymers, das an der negativ geladenen äußeren CW haftet (Abbildung 4D).Hellfeld (BF)-Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM)-Bild zeigt CS-SeNPs, die in die Hefe eindringen (Abbildung 4E), CS haftet an der äußeren CW, mit SeNPs (dunklere Punkte).Abbildung 4 SEM.Anmerkungen: (A) Unbehandelte C. albicans-Biofilme zeigen eine charakteristische eiförmige Morphologie und ein dichtes Netzwerk von Hefezellen und Hyphen (B) mit CS bei 25.000 ppm behandelte Biofilme zeigten vergrößerte und deformierte Hefezellen, (C) mit C. albicans behandelt SeNPs bei 21,7 ppm zeigen Veränderungen in der Morphologie (rote Pfeile) und (D) C. albicans, behandelt mit CS-SeNPs bei 3,5 ppm, weist große Veränderungen in Morphologie und Struktur auf (rote Pfeile), das Polymer haftet am CW.(E) BF STEM-Bild eines C. albicans-Biofilms, der mit CS-SeNPs behandelt wurde.Überall im CW kann beobachtet werden, dass Nanopartikel eintreten, und das CS-Biopolymer, das SeNPs enthält, haftet am äußeren CW.CS-SeNPs, CS-dekorierte SeNPs.Abkürzungen: BF, Hellfeld;C. albicans, Candida albicans;CS, Chitosan;CW, Zellwand;SEM, Rasterelektronenmikroskopie;SeNPs, Selennanopartikel;STEM, Rastertransmissionselektronenmikroskopie;UTSA, Universität von Texas in San Antonio.Visualisierung durch Transmissions-EM (TEM) der Auswirkungen von Nanopartikeln auf vorgeformte C. albicans-BiofilmeIm TEM-Bild beobachteten wir die C. albicans-Hefezelle nach dem Dünnschnitt;Zellen ohne Behandlung zeigten eine charakteristische eiförmige Morphologie und intaktes CW (Fig. 5A).Nach 24-stündiger Behandlung mit CS-SeNPs (3,5 ppm) zeigt sich eine starke Verzerrung der eiförmigen Morphologie der Zelle, und es wird beobachtet, dass CS-SeNPs an der äußeren CW haften (Abbildung 5B und C), metalloide Nanopartikel treten durch Störung in die Zelle ein des CW und der Zellmembran.Elektronenmikroskopische Ultradünnschnitt-Aufnahmen der Hefezellen dokumentieren die intrazelluläre Anreicherung der Nanopartikel.Abbildung 5 TEM.Anmerkungen: (A) Die Ultrastruktur einer unbehandelten Hefezelle von C. albicans zeigt nach dem Dünnschnitt eine charakteristische eiförmige Morphologie.(B und C) Nach 24 h Behandlung mit CS-SeNPs (3,5 ppm) verliert die Hefezelle die charakteristische Morphologie, da sich die Zelle verzerrt, das CW stört und die CS-SeNPs in die Zelle eindringen.CS-SeNPs, CS-dekorierte SeNPs.Abkürzungen: C. albicans, Candida albicans;CS, Chitosan;CW, Zellwand;SeNPs, Selennanopartikel;TEM, Transmissionselektronenmikroskopie.CalcuSyn16 generierte CI-Werte gemäß der Chou-Talalay-Methode.15 Die CS-SeNP-Kombinationsbehandlung war synergistisch, wenn CS (2.500–160 ppm) mit SeNPs (25–1,6 ppm) kombiniert wurde, was zu CI-Werten von <1 führte;bei niedrigeren Dosen war die Wirkung antagonistisch mit CI-Werten von > 1, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die additive Wirkung der Arzneimittelkombination hängt von den individuellen Dosis-Wirkungs-Kurven ab und ermöglicht die Formulierung von Synergie, Additivität oder Antagonismus.Die dosis-wirkungsbasierten Methoden beruhen auf dem Additivitätsmodell von Loewe.12In dieser Studie wurde ein Wildtyp-C. albicans-Stamm SC5314 verwendet;Obwohl dies unter normalen planktonischen (frei schwebenden) Wachstumsbedingungen ein „anfälliger“ Stamm ist, wurde gezeigt, dass Biofilme, die von diesem Stamm gebildet werden, ein hohes Maß an Resistenz gegen die meisten klinisch verwendeten Antimykotika aufweisen.43 Die antimykotischen Eigenschaften von CS30 und SeNPs allein hatten bereits berichtet;40 unsere Gruppe demonstrierte, dass SeNPs an die Hefezelle binden und darin adsorbiert werden, und die wichtigsten physikalischen Eigenschaften von SeNPs gegenüber dem Candida-Biofilm sind Größe und Kristallinität der Nanopartikel.19In dieser Studie demonstrierten wir die erste Synthese von reinen, stabilen und kristallinen Nanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten (PLAL) mit einem Nanosekundenlaser.Diese Lasersynthese eignet sich gut für biomedizinische Anwendungen, da die Oberfläche der hergestellten Nanopartikel frei von chemischen Nebenprodukten oder Tensiden ist.52 Daher wird die biologische Wechselwirkung zwischen der Hefezelle und dem Nanopartikel nicht durch Verunreinigungen verändert.Um dies zu erreichen, wurden die CS-SeNPs durch PLAL in DI-Wasser mit 0,25 % CS synthetisiert, was zu SeNPs führte, die in eine CS-Hülle gehüllt waren, wie durch HRTEM gezeigt wurde;53 diese CS-Hülle ist höchstwahrscheinlich auf die Wechselwirkung der Aminosäuregruppen in CS zurückzuführen die Oberfläche der SeNPs, wo das Koordinationsverhalten der Nanopartikel die Stabilität der Nanopartikel aufrechterhält und die Kristallinität erhöht.54 Die durchschnittliche Größe dieser umhüllten Nanopartikel und das elektrische Potential, das das Partikel umgibt, ZP genannt, wurden mit DLS gemessen.Die Partikel hatten eine Größe von etwa ~100 nm mit einem ZP von –35,7 mV;Dieser große negative Wert bestätigt, dass die CS-SeNPs aufgrund der polykationischen Oberflächenladung des CS30,32,55 in Lösung stabil sind (Abbildung 1A und B).Darüber hinaus kann der leichte Anstieg des ZP-Werts der CS-SeNPs im Vergleich zu den SeNPs auf die polykationische Oberflächenladung des CS zurückgeführt werden und deutet darauf hin, dass CS die SeNPs beschichtet.Die CS und SeNPs allein oder kombiniert wurden durch ein standardisiertes Verfahren auf antimykotische In-vitro-Empfindlichkeit43,56 gegen reife C. albicans-Biofilme getestet, die bekanntermaßen sehr schwer zu hemmen sind, da sessile Zellen innerhalb einer exopolymeren Matrix des Biofilms abgeschirmt werden, der eine intrinsische Resistenz zeigt gegenüber den meisten konventionellen Antimykotika.4,36 Getrennt genommen haben SeNPs (IC50 21,7 ppm) und CS fungizide Eigenschaften gezeigt, aber in Kombination (CS-SeNPs) erzielten sie eine starke hemmende Wirkung (IC50 3,5 ppm) gegen den reifen Biofilm in einer Dosis – Reaktionsweise (Abbildung 3A).Um den synergistischen Effekt der synthetisierten CS-SeNPs zu quantifizieren, verwendeten wir die Chou-Talalay-Methode15, die speziell für Wirkstoffkombinationen entwickelt wurde.Diese Theorie verwendet Algorithmen, die von der CompuSyn-Software13 entwickelt wurden, um Synergie, Additivität oder Antagonismus zu demonstrieren, wie im Diagramm der betroffenen Fraktion (Fa)-CI57 (Abbildung 3C) gezeigt.Wir analysierten die Dosis-Wirkungs-Parameter jeder Verbindung allein (CS und SeNPs) sowie in Kombination und erhielten so den CI-Wert.12,13 Bei höheren Dosen von CS-SeNPs wurde wie erwartet eine stärkere synergistische Wechselwirkung erhalten, und Dosen unterhalb der IC50 wurden antagonistisch (Tabelle 1).Dies ist unseres Wissens nach der erste gemeldete Fall, der die synergistische fungizide Wirkung von CS-SeNPs gegen vorgeformte C. albicans-Biofilme bewies.Teil II.Biomed Res Int.Alle Rechte vorbehalten.Registriert in England und Wales.